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独家专访:面对质疑的韩春雨

2016年10月18日 09:49 来源于 财新网
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任由争议无序发酵下去,显然将有损科学的严肃,不利于中国科学生态的健康发展

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  韩春雨NgAgo论文可重复性争议考验科学界

  重点关注:      

  韩春雨《自然·生物技术》论文的实验结果是否可以被重复和验证?

  一项新的研究遭到众同行质疑,一个科学的解决方法应该是什么

  撰文 | 陈晓雪

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  ►韩春雨的实验室在河北科技大学槐北路校区,而不是生物科学与工程学院所在的新校区,韩春雨办公室的工作人员介绍说,这是因为韩春雨的家就在附近,为了做实验方便。摄影:陈晓雪

  总述

  今年5月,因为一篇刊发在《自然·生物技术》的论文,河北科技大学副教授韩春雨以一夜成名的姿态进入公众的视野,一方面其论文报告了一种可以与国际生物学界流行的基因编辑技术CRISPR-Cas9相媲美的新的基因编辑工具,另一方面也因为韩春雨本人之前籍籍无名,而他所在的单位河北科技大学长时间处于科研前沿的洼地,少有重大科技成果的产出。

  研究成果的重要性与研究者背景之间的强烈反差,让这一故事充满戏剧性,令人倍感振奋。

  《知识分子》较早以特稿形式报道了韩春雨发表的这篇突破性论文,多家媒体也纷纷赶到河北科技大学采访韩春雨实验室;协和医学院、北京大学、浙江大学等高校或研究机构邀请韩春雨做报告;有的实验室直接派人飞到河北石家庄,第一时间与韩春雨实验室建立联系……

  然而,这一被寄予厚望、获得高度评价的研究很快备受质疑。

  距离韩春雨论文发表不到一个月,有人在网上称做重复实验一周无法看到论文报道的结果;质疑接踵而至,国内外多家实验室纷纷报告无法重复韩春雨实验或在其他细胞系内检测不到NgAgo基因编辑的效果;10月10日晚,12名中国科学家实名通过媒体发表声明,称经过多次实验无法重复或再现韩春雨论文的结果……

  今年7月底,《知识分子》注意到韩春雨等人文章面临的可重复性争议,开始陆续询问国内外多位曾经测试过NgAgo基因编辑活性的科学家,其中不乏基因编辑领域的小同行。他们介绍了自己实验室测试NgAgo的过程与结果:

  8月1日,中国科学院动物研究所的研究员王皓毅称,他的实验室首先在小鼠中对NgAgo进行测试发现“不工作”,之后对韩春雨论文的实验进行了部分复制, “一开始有一点点阳性结果,但后来重复就重复不出来了”。

  8月1日,北京大学生命科学学院研究员魏文胜称,他的实验室在对韩春雨的论文进行多次重复之后,“实验结论是完全不工作,没有任何疑虑的不工作”。

  8月2日,美国霍华德休斯医学研究所的大卫·斯特恩(David L. Stern)称,他的实验室在果蝇中对NgAgo进行了测试,“不像论文中说的那么有效”。

  8月2日,澳大利亚国立大学的科学家加埃唐·布尔焦(Gaetan Burgio)称他在小鼠身上没有看到NgAgo编辑基因的效果。

  9月28日,美国有教授称,他利用NgAgo试图在细胞上和小鼠上编辑基因的三次实验全部失败。他不愿公布自己的名字和所属机构。

  10月6日,荷兰瓦赫宁恩大学的微生物学家约翰·范德欧斯特(John van der Oost)称,到目前为止没能再现韩春雨论文结果。

  ……

  无可争议的是,韩春雨发表在《自然·生物技术》的实验结果的可重复性存在巨大的争议,而且到目前为止,《知识分子》所联系到的国内外十余家实验室没有一个表示自己已经可以完全重复或再现韩春雨论文的结果(其中一些实验室在谈完后要求匿名或不做公开报道)。

  在此,《知识分子》选择披露这一历时数月向学术界求证的历程,旨在记录这一段争议的历史,并期望这一事件最终按照科学的规范得到合理的解决。

  在本文中,我们关注的核心问题是:

  韩春雨《自然·生物技术》论文的实验结果是否可以被重复和验证?

  一项新的研究遭到众同行质疑,一个科学的解决方法应该是什么?

  一

  2016年5月2日,河北科技大学副教授韩春雨与合作者在《自然·生物技术》报告了一种新的基因编辑工具NgAgo,能够在哺乳动物的细胞中编辑基因组的DNA。

  这一研究甫一出现,就在中国科学界引起了巨大的轰动,不仅仅在于韩春雨等人找到了一种新的基因编辑工具,更在于论文报告的NgAgo所呈现出来的潜在能力。

  在此前的研究中,具有酶切活性的Ago蛋白都是从嗜热菌中发现的,只有在65°C以上的高温环境下才能生效,因此无法在哺乳动物体内使用而应用价值不高,而韩春雨的论文则找到了一种可以在常温下(37 °C )实现基因组编辑的Ago同源蛋白,使其展现出了广阔的应用前景。

  在此之前,CRISPR-Cas9是基因编辑领域的明星技术。自2012年问世以来,CRISPR-Cas9经过不断的改进,因其操作简便、功能多样,已经成为生命科学领域近些年来最为重要的技术突破。世界范围内的实验室使用它精确编辑植物、动物、甚至是人类的基因组,而风险投资也看中了它在农业、医药、生物燃料等领域的潜力,多个基于CRISPR-Cas9技术的公司创立,其中以麻省理工学院教授、博德研究所核心研究员张锋参与创建的公司Editas Medicine、加州大学伯克利分校的詹妮弗·杜德纳(Jennifer Doudna)创建的Intellia Therapeutics以及瑞典女科学家埃马纽尔·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)与人联合创办的药物研发公司CRISPR Therapeutics最受关注,前两家公司已上市,最后一家亦是IPO进行时。

  韩春雨等人的研究展示了NgAgo作为一种新的基因组编辑工具的多项特性,可以减少脱靶效应的发生,并且NgAgo有着与CRISPR-Cas9可以相媲美的效率,甚至某些时候效率更高。

  在NgAgo身上,人们似乎看到又一个明星技术呼之欲出。

  5月7日,韩春雨向《知识分子》表示,现在的NgAgo“还是最原始的版本,和Cas9刚出来的时候是一样的,以后也会有全世界的实验室对它进行改进的”,他还透露,正在进一步优化NgAgo,并准备在有了新的进展之后投稿。

  二

  韩春雨论文发表后,世界各地的实验室对NgAgo充满了热情,许多实验室在第一时间投入到测试NgAgo的实验中,但质疑声也随之而来。

  5月27日,在最早讨论韩春雨工作的论坛未名空间(mitbbs.com),一ID为“zhouyangq”的用户称,经过一个星期的重复实验,未看到韩春雨《自然·生物技术》论文中报道的结果。

  此后,网上开始不断出现声称不能重复韩春雨论文结果的帖子。7月29日,澳大利亚科学家布尔焦公布自己测试NgAgo的实验过程,表示不能重复韩春雨论文中的Fig.4(图4)的结果。

  加埃唐·布尔焦博士是澳大利亚大学约翰·克汀医学研究中心(the John Curtin of Medical Research)一个研究小组的负责人,同时也是澳大利亚表型组学设施中心(Australian Phenomics Facility)基因改造设施中心的负责人。布尔焦的实验室主要利用下一代测序技术、CRISPR-Cas9基因组编辑等前沿遗传学技术,研究小鼠模型研究宿主与病原体之间的互动。

  和很多人一样,《自然·生物技术》刊发韩春雨论文那天,布尔焦了解到NgAgo。“我认为这个结果非常有趣,值得一试,这可能对实现我们的基因组编辑工作有用。”8月3日,布尔焦8月3日通过邮件告诉《知识分子》。

  韩春雨论文结果显示,NgAgo可在人体细胞中进行基因编辑。布尔焦的实验室没有选择重复韩春雨论文中的实验,而在小鼠胚胎中测试NgAgo的基因编辑效果。布尔焦说,他希望能够比较NgAgo与CRISPR,评估NgAgo的表现是否可以用于实验室的研究工作。

4

  ►7月15日,澳大利亚科学家布尔焦在推特上贴出重现实验成功的图片,后经过测序发现是误读

  7月15日,布尔焦在推特上发表了一组数据,认为自己确认再现了韩春雨的实验结果,但随后遭到很多同行的质疑。布尔焦告诉《知识分子》,他在推特上公布的这一图片起初似乎提示基因组被编辑了,但当通过进一步测序,他发现“绝对可以排除编辑基因组的这个选项”。

  “我没有在人体细胞中重复韩春雨的工作,但我在中国和其他地方的一些同行进行了重复,但不幸的是没有成功。”布尔焦说。

  7月29日,布尔焦发表博文称,他的实验室过去两个月尝试以小鼠为动物模型对NgAgo进行测试,发现NgAgo无法在小鼠受精卵实现编辑基因组的效果。他一并公布了其测试NgAgo的整个过程以及部分实验数据。

  布尔焦测试NgAgo的经历被国内多家媒体报道引用,一时对于韩春雨实验不能重复或重现的质疑达到顶峰。

  布尔焦强调说,他并不认识韩春雨,没有见过韩春雨本人或他的团队成员,也没有和韩春雨有过任何的邮件来往或其他互动。

  “更重要的是,我绝对没有反对中国科学。我在中国有很多科学家朋友,他们都非常聪明、智慧、出色。”布尔焦说,他并不是反对NgAgo,也与CRISRP和NgAgo之间的战争无关,发表那篇博文是想开放自己的实验,让每个人都可以评论,提高自己的工作。

  一位在美国某生物医学实验室做研究的博士后看到布尔焦的博文后说,“(实验)桑格测序的深度不够。看Ago有没有编辑效果,应该做靶点测序,并且要有平行的阴性对照。另外,他的博客上没有显示出阳性对照,同样的靶点位置,设计一个Cas9的sgRNA,同样的实验手段,然后进行肩并肩(side by side)的比较,才更有说服力。”

  《知识分子》把这些意见也反映给了布尔焦。他表示,这些桑格测序的曲线显示出模糊(的噪音),这不可能是编辑的结果;同时,他也以CRISPR做了阳性对照和阴性对照,只是在博文中没有贴出来。

  “到目前为止,这还是一个非常正向的实验。很多人就我实验中的错误、应该如何做实验提出建议。这通常发生在发表一篇科学论文的同行评议过程。在这里,我已经决定,不追逐期刊发表,而是和每个人分享我的数据。这是一个开放同行评议的过程。”布尔焦说。

  布尔焦表示,他现在还不确信NgAgo是否能够或不能够编辑。“它确实对细胞发生了作用,但我对NgAgo如何工作仍感到困惑。它未来也许会是一个潜在的基因组编辑工作,但目前仍需要大量的改进。”布尔焦说,“现在,我的感觉是坚持CRISPR-Cas9,等待NgAgo更多的发展。”

  8月4日,布尔焦博士给《知识分子》的邮件回复中表示,他仍在继续做实验测试NgAgo,“我之前的实验有一些要素(elements),我正在尝试着去理解它们。” 8月5日早晨,布尔焦更进一步回复说,“看看这个酶到底有什么功能”。

  10月17日,布尔焦告诉《知识分子》,为了检测实验中出现的indels是NgAgo导致的还是随机扩增引起的,他还在继续尝试NgAgo,并对韩春雨在Addgene上提供的质粒做了一些改进,在细胞系和小鼠受精卵中检测基因编辑的效果。“这将需要几周去完成。”同时,因为他自己已经放弃了NgAgo这一技术,“检测NgAgo在我的实验室优先权非常低”,“进展缓慢”。

  

  7月29日,布尔焦关于NgAgo实验的博文发表不久,西班牙高等科学委员会(CSIC)下设的国立生物技术中心(Centro Nacional de Biotecnologia)的科学家路易斯·蒙特柳(LIuis Montoliu)在推特(twitter)上转发了他的博文:“赞誉送给布尔焦,他分享了自己的经历,对基因编辑来说,NgAgo不像当初预期的那么好使。”

  资料显示,蒙特柳是位于西班牙的国际转基因协会(ISTT)的共同创始人,并从创立到2014年担任该协会主席。蒙特柳的实验室主要做哺乳动物基因组和转基因动物研究。

  蒙特柳在推特上说,在NgAgo之前,他的实验室曾花了近两年时间尝试测试TtAgo(Ago家族的一种蛋白),但无法实现基因组编辑。他在推特上说,“在布尔焦和众多(实验室)使用NgAgo出现相似的阴性结果后,《自然·生物技术》应要求原文作者分享原始数据和(实验)条件。”

  随后,网上开始流传蒙特柳发给国际转基因协会成员的一封邮件,邮件名为“对Ago非常失望:CRISPR万岁!”邮件说,6月初,NgAgo通过全球科学家质粒共享非盈利组织Addgene发布后,蒙特柳的实验室就开始尝试这一新工具,“但是不久发现事情不对”,NgAgo不像报道的那样起作用。“在科学和技术层面我完全信任的一些同行开始认为,他们无法重复韩的论文结果。”邮件显示。

  邮件中还有一句话被加粗:“NgAgo在哺乳动物细胞内不能编辑基因”。

  7月31日,蒙特柳的邮件被多家媒体报道引用。

  8月3日,《知识分子》邮件联系了蒙特柳教授,询问邮件的真实性,以及邮件中显示的一个针对CRISPR与NgAgo效果的调查来源。

  蒙特柳回复说,他不评论为了科学目的发送给协会内部的私人信息,“这些邮件都没有打算公开投递,却未经许可发表在了公共领域”。

  根据财新传媒的报道,蒙特柳对NgAgo进行了初步测试,但他很快意识到,实验的结果与韩春雨文章描述的不一样。

  “我认为韩春雨博士的工作表现得非常令人激动,充满希望。他在《自然·生物技术》发表的论文令人信服地表明NgAgo可以进行基因编辑。我们都祝贺他的这一工作。然而不幸的是,世界范围内的许多实验室目前的证据认为,NgAgo不能正常工作。我希望这种情况可以得到解决,科学地解决,很快地解决。”蒙特柳在给《知识分子》的回复中说。

  四

  7月29日,美国科学家大卫·斯特恩(David L. Stern)也在推特上转发了布尔焦的博文,“NgAgo不像说的那样有效。(布尔焦的结果)和我在果蝇上的初步结果一致。”

  斯特恩是美国霍华德休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Institute)的遗传生物学家。他的实验室位于美国维吉尼亚州劳登郡的珍利亚农场研究园区,主要研究果蝇的形态演化与发育生物学。

  8月2日,《知识分子》和斯特恩博士取得了联系。

  斯特恩在邮件回复说,他5月上旬读到了《自然·生物技术》发表的韩春雨关于NgAgo的论文。之后,他的实验室就开始着手准备使用NgAgo编辑黑腹果蝇的基因组。

  斯特恩博士向《知识分子》描述了实验的过程。他首先合成了经过果蝇密码子优化的NgAgo,将其克隆到表达载体中。之后,他在体外转录了NgAgo的mRNA并将其注射到果蝇胚胎中。同时,他还订购了磷酸化的 gDNA,而这段 gDNA能够靶向一个之前被证实过的适合 Cas9编辑的位点。他将注射了靶向 Ubx 基因的 Cas9的 mRNA和 gRNA作为对照,在另外一组胚胎中注射了靶向相同位点的 NgAgo的 mRNA和 gDNA。“实验中的mRNA都按相同的浓度注射,gRNA和 gDAN也按照相同浓度注射。”斯特恩说。

  斯特恩发现,所有注射Cas9的胚胎都长出了突变的个体,而注射了NgAgo的胚胎没有一个出现突变的表型。随后,斯特恩又将这些果蝇又传了一代,每个注射了Cas9的个体都产生了突变的后代,而注射了NgAgo的后代则都没有产生突变的后代。

  “NgAgo是否像发表的一样有效,我没有确切的数据,因为我没有尝试精确复制论文中的实验。在一些条件下,NgAgo也许能够在gNDA的介导下精准地切割DNA。”但是,“很明显,即使NgAgo发生作用,在这样的实验条件下,它的效率不如Cas9”,斯特恩总结道。

  在果蝇胚胎测试NgAgo失败之后,斯特恩与韩春雨做了一些沟通,后者给出了几个提高NgAgo效果的建议。但是,斯特恩说,“基于许多研究小组都没能观察到NgAgo能够编辑基因组的结果,我不可能继续使用这一工具”。

  

  “当时看到这篇文章非常惊讶,而且激动,因为第一眼看到这篇文章的data(数据)是almost too good to be true(几乎非常好,应该是真的),我们第一反应是相信这篇文章的。” 8月1日,在成都参加第11届华人生物学家协会双年会的中科院动物研究所研究员王皓毅对《知识分子》说。

  王皓毅马上给韩春雨发了邮件和短信,希望建立合作,但并未得到韩春雨的回复。“他没有回复,我也可以理解,他应该是收到各方面很多信息无法一一回复”。王皓毅回忆说。与此同时,王皓毅本人还写了一篇热情洋溢的文章介绍NgAgo,称之为“一个激动人心的基因组编辑新工具”, 《中国科学》(Science China)2016年6月17日在线发表了这篇文章。

  王皓毅的实验室自己克隆了古菌的NgAgo基因,并且基因合成了人源化的NgAgo,开始在人类293T细胞系中尝试文章中针对GFP质粒以及内源基因的基因编辑实验。在经过大约一两周的实验后,王皓毅的实验室发现, “和很多同行一样。我们看到针对GFP在质粒上的表达是有抑制效果,但对于内源基因的编辑检测不到”。而进一步的实验也无法检测到GFP质粒上的突变,同时control(对照)组的结果表明单链guide DNA本身就对GFP表达有很强的抑制作用,因此GFP的抑制很可能是假阳性的结果。

  之后,他派了自己的学生去韩春雨实验室取质粒,重新在人类293T细胞系中尝试重复利用韩春雨的NgAgo质粒进行基因编辑,但是也没有看到韩春雨论文的结果。

  后来,王皓毅和韩春雨一起参加在北京举行的香山会议。说到实验重复困难的问题,王皓毅说,韩春雨当时回答说实验中需要注意转染的时间,观察的时间可能要久一点,另外做序列分析的DNA需要银染。“我们尝试了一些,各种不work(工作),”王皓毅说。

  与王皓毅一起向《知识分子》介绍实验情况的还有中科院上海神经科学研究所的研究员杨辉。杨辉的实验室对小鼠胚胎进行了三轮实验,用了三个不同版本的NgAgo(密码子优化或者NLS在N端、C端),在细胞上尝试了韩春雨论文中的两三个基因,操作了几百个胚胎,“但是没有效果”。

  魏文胜第一次出现在《知识分子》,是受邀评价韩春雨发表在《自然·生物技术》的工作。 “这篇文章比较聪明,还是走对了路,没有研究如何使高温才能工作的酶通过构象改变达到降温,而是找到这样一株可以在37度工作的Ago。” 5月7日深夜,魏文胜通过微信告诉《知识分子》。

  魏文胜主要从事基因组编辑技术的发展与应用研究。他的课题组也曾试图从Ago家族寻找合适的同源蛋白。随后,魏文胜邀请韩春雨到北京大学生命科学学院做报告,并亲自主持了5月27日的这场报告。

  8月1日,《知识分子》再次联系魏文胜。他告诉我们,从5月上旬开始,他的实验室多次根据韩春雨论文中的实验方法在不同的细胞中做基因编辑的测试,“开始想的是效率很低,但还是工作的,结果我们到最后测序了一下发现完全没有编辑”。

  10月10日晚上,包括魏文胜、王皓毅和杨辉在内的12位科学家(后哈尔滨工业大学教授黄志伟加入,变为13名)通过《中青在线》和澎湃新闻实名发声,宣布他们未能重复或再现韩春雨论文中的实验结果,呼吁有关机构组织第三方介入调查。

责任编辑:崔筝 | 版面编辑:卢玲艳
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