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冷冻电镜:2015年最受关注的新技术

2016年02月04日 15:52 来源于 财新网
《自然·方法》(Nature Methods)的盘点中,2015年最受关注的技术为冷冻电镜技术(cryo-EM)。在冷冻电镜的技术革命中,华人科学家功不可没

  文 | 张凯(剑桥大学MRC分子生物学实验室博士)

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  细胞里面的生命活动井然有序,每一个部分都有其特定的结构,承担不同的功能。生物大分子则是一切生命活动的最终执行者,它们主要是核酸和蛋白。核酸携带了生命体的遗传信息,而蛋白是生命活动的主要执行者。自现代分子生物学诞生以来的半个世纪里,解析和分析生物大分子的结构、进而阐释其功能机制一直都是现代生命科学的核心问题之一。

  事实上,一切自然科学都涉及物质结构及结构间的相互作用为核心的研究方向,天文学研究宇宙、星体等的结构及其相互作用,粒子物理研究物质世界的基本粒子的结构和相互作用,甚至包括应用性很强的材料科学都是以研究新型材料的结构和性质等为核心。结构生物学研究的直接目的是弄清楚生命大分子结构,从而更好地理解生命,理解这个自然界中“逆热力学第二定律”而诞生的奇迹;最终目标是公众通常关心的实用价值。

  像数学物理公式不会直接造出飞机、导弹、计算机一样,蛋白质结构这样的基础研究不会直接转化为人们生产生活的必须物品。比较具体的应用,如药物设计、疫苗开发、医疗诊断和蛋白质分子性能改造(如科学实验或工业生产中酶活性稳定性优化)等是蛋白质结构研究比较容易被大众所理解的一个方向,但却只是其研究价值的一个侧面而已。

  蛋白质结构如同生命科学里的数学公式和物理定律,甚至在以后会充当生命科学里面的“化学元素周期表”,除了帮助发现或设计新药等,它更重要的价值是作为最基础最上游的研究之一,通过影响一切与其密切相关的下游科学和技术,从而改变我们的世界。

  结构生物学最早诞生于上个世纪中叶,它是一门通过研究生物大分子的结构与运动来阐明生命现象的学科,在其发展史上有两个里程碑式的事件,一个是DNA双螺旋结构的发现,另一个肌红蛋白(Myglobin)晶体结构的解析,这两个事件都是上个世纪最重要的革命性科学进展,均在剑桥MRC分子生物学实验室完成,并且都于1962年获得了诺贝尔奖(一个生理学或医学奖,一个化学奖)。同时它们都是最早使用X射线的方法来解析生物大分子结构,而这个方法在过去半个世纪里,一直占据结构生物学的统治地位。

  在当今结构生物学研究中普遍使用的冷冻电镜,是上个世纪七八十年代开始出现、近两年飞速发展的革命性技术,它可以快速、简易、高效、高分辨率解析高度复杂的超大生物分子结构(主要是蛋白质和核酸),在很大程度上取代并且大大超越了传统的X射线晶体学方法。

  革命性的冷冻电镜技术

  冷冻电镜并不是这两年才建立的。在蛋白质X射线晶体学诞生大约10多年以后的1968年, 作为里程碑式的电镜三维重构方法,同样在剑桥MRC分子生物学实验室诞生,Aron Klug教授因此获得了1982年的诺贝尔化学奖。另一些突破性的技术在上世纪70年代和80年代中叶诞生,主要是冷冻成像和蛋白快速冷冻技术。这里面的代表科学家有Ken Taylor, Robert Glaeser和Jacques Dubochet等。

  快速冷冻可以使蛋白质和所在的水溶液环境迅速从溶液态转变为玻璃态,玻璃态能使蛋白质结构保持其天然结构状态,如果以缓慢温和的方式冷冻,这个过程会形成晶体冰,生物分子的结构将被晶格力彻底损坏。低剂量冷冻成像能够保存样品的高分辨率结构信息,确保了从电镜图形中解析蛋白质结构的可能性。与此同时Joachim Frank等则在电镜图像处理算法方面奠定和发展了这项技术的理论基础。由此冷冻电镜的雏形基本建立,总的思路为:

  1)样品冷冻(保持蛋白溶液态结构);

  2)冷冻成像(获取二维投影图像);

  3)三维重构(从二维图像通过计算得到三维密度图)。

  该方法为生物大分子结构研究提供了一个和X射线晶体学完全不一样的、全新的思路。但是由于技术方法的瓶颈,在此后30多年的时间里只能做一些相对低分辨率的结构解析工作,在分辨率上一直不能和X射线晶体学比较,甚至一度被嘲笑为”blob-ology“(英文讽刺语,“一坨轮廓的技术”)。

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冷冻电镜三维重构得到的电子云密度图和原子模型(局部)。张凯供图

  但对于冷冻电镜来说,技术难点远非单纯冷冻。冷冻成像和图像处理算法一直都是瓶颈。从冷冻电镜技术诞生以来的近30年时间里,其一直都有进展,只是相对比较缓慢。

  最重要的革命性事件大约发生在两三年前:一个是直接电子探测器的发明,另一个是高分辨率图像处理算法的改进。MRC分子生物学实验室的两位科学家Richard Henderson和Sjors Scheres在这次革命中起了关键作用(作者注:现代科技革命往往是诸多研究机构若干团队共同参与,此处仅列举关键代表,并且仅从技术角度讨论,不涉及生物学应用)。

  Richard Henderson是探测器方面的先驱,而Sjors Scheres则因他设计的Relion程序而名声大噪,他们由此当选为《自然》杂志2014年“十大科学进展年度人物”。两位科学家一个从硬件,一个从软件将冷冻电镜技术推向了巅峰,将冷冻电镜技术的分辨率推向了新高度。(作者注: Henderson教授的贡献远非探测器一个方面,包括冷冻电镜理论基础、算法、软件,重要生物大分子应用,如曾首次解析视紫红质跨膜螺旋等等方面;早在20多年前,他就通过一系列理论分析,预言了冷冻电镜研究的尺度、分辨率极限、技术瓶颈等等,并且断言:冷冻电镜将超越其它一切技术方法,成为蛋白质结构研究的主导工具,如今这些预言全部应验。)

  和此前使用的CCD相比,新发展的直接电子探测器不仅在电镜图形质量上有了质的飞跃,同时在速度上大幅提高,还可以以电影的形式快速记录电镜图像。这些特性同时也伴随着电镜图像处理方面的重大变革,电镜技术此前在分辨率上的一个主要瓶颈是电子束击打生物样品造成的图像漂移和辐射损伤。有了快速电影记录,我们就可以追踪图像漂移轨迹而对图像做运动矫正和辐射损伤矫正,大大提高数据质量。

  尽管如此,电镜图像处理一直都是一项极具挑战性的任务,主要的问题是冷冻电镜的图像噪音极高、信号极低,而我们的目标是从中提取近原子分辨率的结构信息,这就像在一个机器轰鸣的工厂里监测一只蚂蚁爬行的声音。冷冻电镜科学家就是要完成这项艰巨的任务,并且真的做到了。有了硬件和软件方面的双重提高,冷冻电镜的分辨率目前已得到了极大的提高,可以和晶体学相媲美;并且在其它方面已经大大超越了晶体学。

  主要体现在下面几个方面:

  第一,不需要结晶,研究对象范围大大扩展,研究速度大大提高。对于小分子,比方说无机盐矿物质等自发就能长出晶体,小而且稳定的蛋白质目前来说结晶并不困难,但是这类意义重大的蛋白几乎都已经解析完了,在科学上没有任何重大意义;当今时代,小蛋白已经完全不能满足科学家们强烈的探索欲望,结构生物学研究的对象越来越大,体系越来越复杂,结晶几乎成为不可能的事情,即使能结晶,也不一定衍射,有衍射也不一定能得到原子分辨率结构。

  很多年前,许多蛋白质晶体科学家为了完成一项艰巨的任务,一个课题少则5到10年,多则20年,核糖体从上世纪80年代初首次长出晶体到2000年左右最终拿到原子分辨率结构整整经历了20年;线粒体呼吸链复合物I从上世纪90年代初研究,第一次报道完整晶体结构大约是20年以后。

  而冷冻电镜方法跳过超大分子复合物结晶难的这层技术屏障,以直接解析复合物的溶液状态的结构为目标。

  现在利用这项技术,在MRC-LMB一周时间就可以解析一个新的核糖体结构;英国皇家学会主席、MRC-LMB结构中心主任Venki Ramakrishnan 教授,因为核糖体的晶体结构研究而获得2009年诺贝尔化学奖。他的实验室在2014年发表了最后一篇晶体结构文章,此后的文章全部以冷冻电镜为主。哥伦比亚大学有一个非常执着的博士后,研究兰尼碱受体(Ryanodine Receptor)晶体结构长达十年之久,最后放弃了晶体,转向了冷冻电镜技术,同时与清华大学教授颜宁和LMB的Scheres研究组合作,几个月就解决了这个难题,并且达到近原子分辨率。

  第二,样品需求量小,样品制备快,可重复性高。重要生物样品都是非常珍贵的,总体来说是以微克或者最多以毫克来计量,即使得到这点样品,也要花费生物学家几周、几个月甚至更长的时间(大多数时候都需要摸索各种条件使样品处于相对稳定的状态,以便做进一步结构研究)。

  蛋白质晶体一般要求高浓度大体积,没有量变就没有质变。而同样量的蛋白可以稀释以后制备若干冷冻电镜样品,每个样品有成百上千的区域,每个区域有几百个小孔,每一个小孔甚至可以收集多张照片。解析一般蛋白的原子结构需要几万个颗粒,而对于高对称性的样品几千个颗粒就足够。

  第三,可以研究天然的、动态的结构。X射线晶体学研究生物大分子结构的一个主要弱点是无法拿到天然的动态的结构,这是因为研究人员无论如何也无法绕开结晶这个过程。冷冻电镜就是要做这件事情:直接解析天然的、溶液态的、动态的(dynamic),甚至原位(in situ)的结构,从而理解生命分子如何在空间和时间两个尺度上以活的动态的方式发挥功能。

  晶体学只能尝试不同的条件获得生物大分子某个或者某些固定的状态,而且容易出现晶体堆积引起的不真实相互作用方式。形象地说,冷冻电镜可以制作完整的高清电影,晶体学只能从电影里截屏。

  第四,技术革命还将开启巨大的潜在医疗价值。冷冻电镜技术方法在时间和精度方面的大幅度提高有时会导致不可预测的重大科学和应用价值。比如,活体病毒结构分析如果可以在分钟级别完成,这将有可能转化为潜在的医疗检测手段:从病人体内抽取血样或感染组织细胞,几分钟以后,非常清晰明了地展现病人在细胞内部结构层面的异常状况,甚至给出局部的原子结构图,从而给出精准的治疗方案。这个想法现在可能听起来有点像笑话,或许再过若干年人们就不这样认为了。

  当然冷冻电镜的革命性不仅仅体现在上述四方面,在此就不一一列举。有关冷冻电镜更加详细的介绍,可参见笔者等2010年的中文综述(《生物物理学报》,2010年7月,第26卷,第7期: 533-559)。文章中对未来几年的发展趋势所做的展望,如直接电子探测器的普及、非对称性蛋白复合物近原子分辨率结构解析、冷冻电镜相关计算性能的大规模提升等等,目前绝大多数都在过去的两三年内得以实现并飞速发展。

责任编辑:崔筝 | 版面编辑:张柘
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